Fotometeret

toc Forfatter: Sacha-Natascha m02bS13 Kanchana Jensen m02bS13

=**Fotometer**= Et fotometer er et apparatur, som anvendes til at måle en opløsnings absorbans. Til dette formål anvendes to hovedtyper af fotometre; enkeltstrålefotometre og dobbeltstrålefotometre. Ud fra absorbansen kan man identificere et stof og bestemme stoffets koncentration. Et dobbeltstrålefotometer kan anvendes til at finde stoffets absorbansspektrum, dvs. mængden af lys der absorberes af stoffet, som funktion af lysets bølgelængde. Hvert stof kan identificeres ud fra sit karakteristiske absorbansspektrum af bølgelængder med bølgetoppe (peaks) og bølgedale og hermed stoffets målebølgelængden.

Ved at kende målebølgelængden af et stof, altså bølgelængden med høj absorbans, kan man anvende et enkeltstrålefotometer til at bestemme koncentration af et stof. Ifølge Lambert Beers lov er et stofs absorbans ved en bestemt bølgelængde ligefrem proportional med koncentration af stoffet. Man anvender et enkeltstrålefotometer til at måle absorbanser af en eller flere kalibratorer med kendte koncentrationer af opløsningen, og resultaterne fremstilles på en kalibreringskurve for at vise denne sammenhæng. Ud fra kurven kan man bestemme forskellige ukendte koncentrationer af stoffet.

=**Opbygning**= Et fotometer indeholder en lyskilde som sender lyset gennem en indgangsspalte ind i en monochromator. Monochromatoren sender monochromatiske lys videre til en kyvette der indeholder den oplysning af stoffet, der skal måles på. Omdannelsen af lysenegien til elektrisk energi foregår i en lysdetektor som er placeret efter kyvetten.
 * **Enkeltstrålefotometer**
 * Filterfotometre
 * Spektrofotometre

Et enkeltstråle filterfotometer er et fotometer med fast bølgelængde og et filter som monokromator. Lysstrålen passerer igennem en enkelt kuvette.

Et enkeltstråle spektrofotometer har en beholder og er den simpleste type spektrofotometer. Et spektrometer er et fotometer der kan måle ved flere forskellige bølgelængder hen over et spektrum.


 * **Dobbeltstrålefotometre**
 * Spektrofotometre

Et dobbeltstråle-spektofotometer er et fotometer, hvor en strålesplitter spalter lysstrålen, således at strålen passerer skiftevis gennem prøven og referencekyvetten. Dette fotometer fortrækkes til optegning af et absorbansspektrum, da den automatisk nulstiller referenceopløsning, ved at trække absorbansen af prøveopløsningen fra reference opløsningen. __**FOTOMETER KOMPONENTER****:**__ //**Lyskilder**// Forskellige typer lamper udsender forskellige bølgelængder. Dette skal man tage hensyn til, når man vælger sin lyskilde til sine fotometriske målinger. Ønsker man at måle i det synlige område, anvendes en wollfram-halogenlampe, men skal man derimod foretage spektrometriske målinger i UV-området, skal man i stedet anvende deuterium-lampen, som udsender relativt meget lys i UV-området, i forhold til Wollfram-halogenpæren.

//**Monochromator**// Monochromatoren, er den optiske genstand, der mekanisk udvælger en bestemt bølgelængde fra lyskildens kontinuert spektrum. Man siger, at jo smallere bølgelængden er jo bedre er monokromatorens monokromasi, dvs. evnen til at vælge en bestemt bølgelængde. Det monokromatiske lys som vælges af monokromatoren har betydning for den linære sammenhæng mellem absorbans og koncentration( Lambert-Beers lov).

Der findes forskellige slags monochromatorer, og de inddeles i to grupper, alt efter hvilke typer fotometre der anvendes. Monokromatorer med fast bølgelængde som f.eks. glasfilter og interferensfilter anvendes i filterfotometre. Hvorimod et diffraktionsgitter med variabel bølgelængde anvendes som monokromator i spektrometre. Glasfiltret består af glas tilsat et farvestof, og glassets farve har betydning for hvilke bølgelængder der må passere glasset og hvilke bølgelængder der absorberes af glasset. F.eks.et rødt glasfilter vil tillade det røde lys at passere og de øvrige bølgelængder absorberes.
 * **Glasfilter**

Interferensfiltret består af et meget tyndt gennemsigtigt stof(MgF2) mellem to sølvmetalfilm. Tykkelsen af MgF2 lag er 1/2 af den bølgelængde man ønsker skal passere filtret. Sølvfilmene har en spejlende effekt på lysstrålerne som få lov til at passere igennem. Strålerne reflekteres frem og tilbage mellem de to sølvfilm og kun de lysstråler hvis svingninger er i takt forlader filtret igen. Dette kaldes for konstruktiv interferens. Omvendt vil de lysstråler som 'modarbejder' hinanden,dvs. destruktiv interferens udslettes. Der vil også opstå konstruktiv interferens ved andre bølgelængder end den valgte: F.eks, bølgelængde = 510nm, konstruktiv interferens ved 510/1=510nm, 510/2= 255nm, 510/3= 170nm osv.
 * **Interferensfilter**



Diffraktionsgittret består af en serie parallel spalter som er indgraveret i en reflekterende overflade. Når parallele lysstråler rammer en bestemt indgravning på gitteret splittes lyset op i det forskellige bølgelængder. Man kan vælge et bestemt bølgelængde ved at ændre gitterets position.
 * **Diffraktionsgitter**



(A: Det indkomne lys, B: spalte, C: kollimator - et krumt spejl der samler lyset,D: diffraktionsgittret der bryder lyset,E: Kondensor som samler lyset igen,F:spalte - lyset sorteres fra,G: lys med en bestemt bølgelængde forlader diffraktionsgitret.)

De forskellige monochromatorer har forskellige monochromasi. Monochromatorens lysintensitetskurve målt ved den halve højde benyttes som et mål for monochromators monochromasi. En god monochromator er halvbølgeværdien fra 0,1 nm til 10nm. Monochromasi for de omtalte monochromatorer er;
 * Halvbølgeværdi**
 * Glasfitre: 50-100nm
 * Interferensfiltre: 10-20nm
 * Diffraktionsgitteret: ned til 0,5 nm.

//**Kyvetter**// Kyvetter er små beholder lavet i plastisk, glas eller kvarts. Man kommer sit stof i kyvetten, som er gennemsigtig, og lyset lyser igennem kyvetten og stoffet. Det er derfor vigtigt at vælge en kyvette af rette materiale. For eksempel kyvetter lavet af kvarts er mest egnet til målinger i UV -området. Nogle kyvetter af plastik er udmærket at anvende i både UV område og det synlige lys, mens andre absorberer UV lys. Man kvalitetssikre kyvetterne, før man tager dem i brug. Har de ridser for eksempel på glaskyvetter eller fedtfingre, vil man få et upræcist resultat.

Lysdetektor registrerer det transmitterede lys som lyssignal omdannet til elektrisk signal. Der findes to typer lysdetektor; fotomultiplikatorrøret og fotodiode. //**Fotomultiplikatorrøret**// Fotomultiplikatorrøret er et glas-vaccumrør, der forstærker det elektrisk signal, så det kan registreres. I den elektronmultiplikator del af detektoren er der placeret en fotokatode, en serie af hjælpeelektroder, kaldet dynoder og en anode. Hver dynode er ca. 90 V mere positiv end forrige dynode. Belysningen af den lysfølsomme fotokatoden igangsætter frigivelser af elektroner ved den første dynode, hvor 2 til 5 elektroner slås løs. Denne proces accelereres/multipliceres ved hver dynode pga. den bevægelses (kinetisk) energi, elektronerne får ved at støde sammen med de stigende positive ladede dynoder. Hver elektron kan giver 10.000 - 10.000.000 elektroner ved anoden, og denne ophobning af elektronerne ved anoden registreres som en elektrisk puls. Lysintensiteten skal indebære en vis mængde energi for at kunne sætte elektronfrigivelses forløb igang. Hvis intensiteten er lav vil detektoren ikke kunne registrere den elektrisk signal. Omvendt hvis intensiteten er høj vil detektoren overbelastes.
 * //Lysdetektor//**

[|Fotodioden]er en halvlederdiode som kan arbejde ved lav spænding. I modsætning til fotomultiplikatorrøret er fotodioden lille, robust og billig. Til gengæld er den ikke så følsom og fungerer i område fra 200 -1.100nm. Fotodiodens lille størrelse gør det muligt at placere en række fotodioder ved siden af hinanden. Ud fra antallet af fotodioden på rækken kan dette såkaldte fotodiode-array registrere mange bølgelængder på en gang.
 * Fotodioden**

=**Anvendelse**= Fotometre er bredt anvendt som analyseudstyr på hospitalers forskellige kliniske afdelinger. Fotometriske målinger udført af fotometre er analyseprincippet bag mange af undersøgelser fortaget til bestemmelse af f.eks. koncentration af diverse plasma proteiner.

Eks: Intergra800 anvender fotometri, til at finde resultater. Den bruges blandt andet til at kontrollere infektionstallene, som måles ved CRP. CRP er et C-reaktivt protein, der ligger i blodets plasma. Ved en akut infektion bliver koncentrationen øget, og derfor benyttes CRP til at vurdere om der er en infektion eller ej. Der dannes et præcipitat, som måles ved en bølgelængde på 552 nm. Man kigger på hvor meget lys, der absorberes, samt på lysets spredning. Det er antigen/antistof, der laver spredningen.

__**Links til anvendelse af fotometre:**__ [] **P-hæmoglobin(Fe)-stofk.;** [] **P-ethanol;** []
 * [|F]orskellige P-proteiner; **

__**Link til dobbelstråle-spektometer:**__ http://www.youtube.com/watch?v=O39avevqndU&feature=related

__**Litteratur:**__ Dragsdorff,Bruno (Maj. 2006)//Basal Fotometri.// Bioanalytikeruddannelsen, København

Petersen, Mette la Cour (Nov. 2010) // Kompendium i generelle analyseprincipper // .( Kap.21 & 22, Fotometri )Bioanalytikeruddannelsen, København